با لب پر ز سکوت غنچه

   من دعا می خوانم

   با دل سرشار از فریاد موج

   من پر از شور و حیات

   و پر از شوق رسیدن به خدا

   و چقدر شادم من

   و چقدر زندگی امروز قشنگ و زیباست

   آری

        آری

   که جهان پر ز تمنای تماشاست

   من خدا را خواندم

   وقتی از شوق درون خود نمی گنجیدم

   و جهان را دیدم

   و جهانی که پر از زیباییست

   و خدا خواست که احساس کنم دنیا را

   و خدا خواند مرا به افق

   که از آن شوق پریدن را احساس کنم

                                        و چقدر شادم من...

 به نقل از سایت سازمان سنجش :

  انواع سلولهای خون

مقدمه

خون را باید بافتی به شمار آورد که زنده و فعال است و فعالیتهای حیاتی کلیه اندامهای بدن به نحوی با فعالیت و سلامت این بافت بستگی دارد. اگر مقدار خون از یک انسان بگیریم و درون لیوانی بریزیم و آنرا در یخچال نگهداری کنیم تا منعقد شود پس از مدتی بخشی از خون رسوب می‌کند و محتوای لیوان به دو بخش مشخص تقسیم می‌شود. بخش بالایی که مایعی شفاف و به رنگ زرد بسیار کم رنگ است پلاسما نام دارد و در زیر پلاسما ، توده قرمز رنگی دیده می‌شود که محتوی گلبولهای قرمز است بین پلاسما و توده گلبولهای قرمز یک لایه بی‌رنگ دیده می‌شود که از اجتماع گلبولهای سفید خون شکیل شده است.

انواع سلولهای خون: گلبولهای سفید ، گلبولهای قرمز و پلاکتها

گلبولهای سفید

این گلبولها در مغز استخوان ، تیموس ، گره‌های لنفاوی و طحال تولید می‌شوند گلبولهای سفید کلیه اجزای یک سلول جانوری را دارند و همه نوع فعالیتهای حیاتی را انجام می‌دهند. تعداد گلبولهای سفید در هر میلیمتر مکعب خون انسان در حدود هفت هزار است که در مقایسه با تعداد گلبولهای قرمز این مقدار بسیار کم است. گلبولهای سفید به دو گروه گرانولوسیت (دانه‌دار) و آگرانولوسیت (بدون دانه) تقسیم می‌کنند.

گرانولوسیتها

هسته چند قسمتی و سیتوپلاسم آنها دانه‌دار است و 70 درصد از گلبولهای سفید خون را تشکیل می‌دهند. این گلبولها خاصیت بیگانه خواری دارند و به هنگام گردش در خون ، باکتریها و سایر مواد خارجی را با ایجاد پاهای کاذب و عمل فاگوسیتوز به درون خود می‌کشند و آنها را هضم می‌کنند و از بین می‌برند. این گلبولها همچنین می‌توانند از میان سلولهای پوششی جدار مویرگها عبور کرده و وارد فضای بین سلولی شوند و این عمل سلولهای سفید را دیاپدز می‌گویند. گرانولوسیتها به سه گروه تقسیم می‌شوند.

• نوتروفیلها

سلولهای کروی ، هسته دارای دو یا چهار لب پیوسته به هم توسط رشته‌های باریک است. 15 - 12 میکرومتر قطر دارند. و کار فاگوسیتوز (ریزه خواری) جانداران میکروسکوپی را انجام می‌دهند.

• بازوفیلها

سلولهای کروی ، هسته با دو لب نامشخص و 12 - 10 میکرومتر قطر دارند. و هیستامین که باعث التهاب بافتها می‌شود و هپارین که جلوگیری از تشکیل لخته می‌کند را آزاد می‌سازند.

• ائوزینوفیلها

سلولهای کروی ، هسته‌ها اغلب دو لب دارند، 12 - 10 میکرومتر قطر دارند و مواد شیمیایی که باعث کاهش التهاب می‌شود ترشح می‌کنند و به کرمهای انگلی معینی حمله می‌کنند.

آگرانولوسیتها

هسته نسبتا درشت و سیتوپلاسم یکنواخت دارند و شامل لنفوسیتها و مونوسیتها هستند.

• لنفوسیتها

سلولهای کروی با هسته گرد ، سیتوپلاسم تشکیل حلقه باریک را در اطاف هسته می دهد 8 - 6 میکرومتر قطر دارند. لنفوسیتها در افراد بالغ حدود 25 درصد از گلبولهای سفید را تشکیل می‌دهند. و بیشتر در دستگاه لنفاوی یافت می‌شوند. لنفوسیتها دو نوعند : نوع B که در مغز استخوان تولید و بالغ می‌شوند. اما در گره‌های لنفاوی جای می‌گیرند و نوع T که پس از ساخته شدن در مغز استخوان در تیموس مراحل رشد و نمو خود را طی می‌کنند.

ظاهر لنفوسیتها T , B در زیر میکروسکوپ بهم شبیه است اما فاصله‌های آنها متفاوت است. سلولهای B آنتی کور (پادتن) ترشح می‌کنند. آنتی کورها ملکولهای پروتئینی و از نوع گلوبولین‌ها هستند. سلولهای T بر خلاف سلولهای B در سطح فرد گیرنده‌های آنتی کور مانندی دارد که به کمک آنها به آنتی ژن میکروبها می‌چسبند. بدین ترتیب سلولهای T متحرک هستند و خود به محل عفونت یافته می‌روند.

• مونوسیتها

سلولهای کروی یا نامنظم می‌باشند. هسته‌ها گرد یا کلیدی شکل و یا نعل اسبی شکلند. نسبت به لنفوسیتها ، سیتوپلاسمبیشتری دارند. 15 - 10 میکرومتر دارند. در خون به عنوان سلولهای فاگوسیت کننده عمل می‌کنند دستگاه گردش خون را ترک کرده و تبدیل به ماکروفاژها می‌شوند که باکتریها ، سلولهای مرده ، اجزای سلولی و بقایای درون بافتی را فاگوسیتوز می‌کنند در بدن بخصوص در کبد ، طحال و گره‌های لنفاوی یافت می‌شود.

گلبولهای قرمز

گلبولهای قرمز (اریتروسیتها) به شکل دیسکهای مقعرالطرفین ، بدون هسته و 8 - 7 میکرومتر قطر را دارند در انتقال اکسیژن و دی‌اکسید کربن دارند و به تعداد تقریبی 5 میلیون در هر میلیمتر مکعب خون یافت می‌شوند گلبولهای قرمز زنده‌اند و مواد غذایی را از راه تخمیر بدست می‌آورند، زیرا میتوکندری ندارند و همچنین هسته متوسط گلبولهای قرمز 120 روز است برای اینکه میزان گلبولهای قرمز در خون ثابت بماند باید در هر ثانیه حدود یک میلیون گلبول قرمز در مغز استخوان ساخته شود. گلبولهای قرمز در دوره جنینی در کبد به طحال و گره‌های لنفاوی ساخته می‌شود اما در ماههای آخر دوره جنینی و پس از تولد تنها در مغز قرمز استخوان بوجود می‌آید.

در مغز استخوان بافت زاینده‌ای وجود دارد که با چند تقسیم سلولی گلبولهای قرمز را می‌سازد. سلولهای زاینده در ضمن این تغییرات هسته خود را از دست می‌دهند و مقداری زیادی هموگلوبین در ستوپلاسم خود می‌سازند. فعالیت ماهیچه‌ای ، صعود به ارتفاعات و گرم شدن هوا تولید گلبولهای قرمز را افزایش می‌دهد سلولهای مولد گلبولهای قرمز در مغز استخوان نسبت به اشعه ایکس بسیار حساسند و کمبود ویتامین B₁₂ ، آهن ، مس در غذا نیز موجب کاهش تولید گلبولهای قرمز می‌شوند.

پلاکتها

این سلولها بسیار ریزند و شامل قطعات سلولی که بوسیله غشای سلولی است احاطه شده است و حاوی دانه‌هایی می‌باشند 5 - 2 میکرومتر قطر دارند. و در عمل انعقاد خون نقش دارند و مواد شیمیایی لازم را برای لخته خون آزاد می‌کنند .

مطالعه سلولهای خونی در زیر میکروسکوپ

     درس پنجم    

14-P.C.I extraction  

هدف از اين  كار حذف پروتئنهاي موجود در محلول حاوي DNA ميباشد . فنل ( equilibrated phenol با  pH بيشتر از 7.5) موجب دناتوده شدن پروتئنها ميشود و كلرفرم نيز بقاياي فنل را از محلول واكنش حذف ميكند .

1-  هم حجم محلول حاوي DNA  فنل  اضافه كنيد و مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ( فنل متعادل شده به علت 8-hydroxyquinoline ماده آنتي اكسيدان ) زرد رنگ است و روي آن با يك لايه بافر تريس پوشانيده شده است هنگام استفاده از فنل زير بافر استفاده كنيد)

2- مايع رويي ( مايع شفاف ) را به لوله تميز ديگري انتقال دهيد ( فنل در زير قرار ميگيرد و پروتئنهاي دناتوره شده بين دو لايه قرار ميگيرند).

3-  هم حجم آن از مخلوط كلرفرم -  ايزو  آميل  الكل   ( 1:24) اضافه  كنيد( ايزو آميل الكل يك ماده Anti foam    است و مانع كف كردن محلول ميشود )  و مانند مرحله قبل ادامه دهيد

4-  مايع رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد    ويا مانند روش زير ميتوان عمل نمود:

5- مخلوط فنل - كلرفروم - ايزو آميل الكل  (به نسبت  1:24:25) تهيه كنيد

6- حجم مساوي از مخلوط P.C.I به محلول حاوي DNA اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد

7- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد و هم حجم آن C.I اضافه كنيد و 5 دقيقه سانتريفيوژ كنيد

8- محلول رويي را به لوله تميز ديگر انتقال دهيد (محلول حاوي DNA  است )

9- اگر هنوز بوي فنل از آن متصاعد ميشود مرحله  7 را تكرار كنيد.

 10- DNA را با الكل رسوب دهيد( تغليظ DNA ).

15- رسوب DNA  با الكل ( تغليظ DNA  )

هدف از اين كار احياي DNA  بعد از استخراج و يا بعد از P.C.I. extraction  ميباشد و در مواقعي نيز كه DNA  خيلي رقيق باشد بدينوسيله آن را تغليظ ميكنيم.

1- حجم محلول حاوي DNA  را  تعيين كنيد ( تخمين بزنيد )

2- استات سديم با غلظت نهايي  0.3M به آن  اضافه كنيد .

3.- مقدار دوبرابر حجم آن الكل مطلق سرد ( 20- يا 70-) اضافه كنيد

4-  مدت 10 دقيقه با 12000xg سانتريفيوژ كنيد . رسوب سفيد رنگ را ميتوان در ته لوله مشاهده نمود ( لازم به ذكر است كه DNA خالص تقريبا" بيرنگ است ).

5- . با وارونه كردن لوله , مايع رويي را حذف كنيد و لوله را بصورت وارونه روي كاغذ جاذب الرطوبه قرار دهيد تا آب آن حذف شود .

6-  مقدار 100 ميكرو ليتر الكل 70 درجه به آن اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد تا رسوب DNA  از ته لوله كنده شده و شناور گردد ( اگر DNA  بزرگ با شد ورتكس موجب شكسته شدن آن ميشود) .

7- مدت 5 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستن DNA)

الكل را خالي كرده و DNA را در 70 درجه خشك كنيد ( چنانچه در اين مرحله DNA خوب خشك نشود والكل همراه  آب داخل آن بماند بعدا" براي كار كردن با آنزيمها دچار اشكال ميشويد). DNA را در مقدار بافر ( آب ) دلخواه حل كنيد .

16- احياي DNA  از ژل آگارز

هدف از اين قسمت كسب مهارت براي  احياي DNA   از روي ژل آگارز ميباشد. اين تكنيك در بيولوژي مولكولي و مهندسي ژنتيك اهميت زيادي دارد و در كلونينگ و انتقال ژن استفاده ميشود  لازم به ذكر است كه  از طرق مختلف اين كار انجام ميشود مانندFreez- Squeez, paper elution, Electero elution , و... ولي فقط دو روش توضيح داده ميشود :

الف ) احياي DNA  ازروي ژل توسط كاغذ ( paper elution ) 

1-  DNA  مورد نظر رابا ژل آگارز 1-2درصد  الكتروفورز كنيد و اجازه دهيد تانوارهاي  هاي DNA بخوبي از همديگر تفكيك شوند

2- با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب آسب DNA  ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) نوارهاي  مورد نظر را مشاهده كرده و جلو آن را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد

3- در جلو band  يك حفره ايجاد كنيد ( عرض حفره مساوي عرض band  باشد )

4-  يك قطعه كاغذ واتمن و يك قطعه كيسه دياليز ( dialysis tubing )  به اندازه حفره ببريد

5.- كاغذ واتمن را در جلو حفره و كيسه دياليز را در پشت كاغذ قرار دهيد

6-  الكترو فورز را ادامه دهيد ( بافر تانك را كمتر كنيد بطوري كه روي ژل را نپوشاند )

7- وقتي DNA  وارد كاغذ شد الكترو فورز را متوقف كنيد

8.- كاغذ را جمع كرده و به لوله 5/ ميلي ليتري كه انتهاي آن سواخ شده است انتقال دهيد

9. توسط سمپلر مقدار مناسب با فر

 (150mM NaCl , 20mM Tris (pH=7.5) 1mM EDTA , 5%SDS) روي كاغذ بريزيد

10-  لوله مذكور را داخل يك لوله بزرگتر قرار دهيد ( 5/1 ميلي ليتر ) ، سانتريفيوژ كنيد تا مايع از ته لوله كوچك به داخل لوله بزرگتر حركت كند ،  چند دفعه اينكار را تكرار كرده تا موقعي كه ديگر DNA  روي كاغذ واتمن مشاهده نشود ( با نور UV  آزمايش شود )

11-  اين بافر را جمع آوري كرده و با P.C.I  استخراج كرده و با الكل  تغليظ كنيد

ب)  احياي DNA    از روي ژل آگارزLow Melting Point (LMP)

1- DNA مورد نظر را با آگارز LMP      2درصد الكترو فورز كنيد و اجازه دهيد تا نوارهاي DNA خوب تفكيك شوند

2-  با نور UV ( طول موج 254 نانومتر موجب اسيب DNA  ميشود و بهتر است از طول موج 312 نانومتر استفاده گردد ) band  مورد نظر را مشاهده كنيد

3- band  مورد نظر را با تيغ اسكالپر تميز علامت گذاري كنيد

4-  ژل را روي كاغذ سفيد قرار داده و band  مورد نظر را بريده به لوله تميرديگر منتقل كنيد

5-  قطعه ژل را يك شب در فريزر 20- درجه قرار دهيد

6-  قطعه ژل را در حرارت اتاق قرار دهيد و سپس 5 دقيقه در آب 65 درجه انكوبه كنيد

7-آن را به حرارت اتاق منتقل كرده و دو مرتبه با P.C.I  استخراج كنيد تا ژل از آن حذف شود

8.- استات سديم ( غلظت نهايي  0.3M  ) اضافه كرده با الكل رسوب دهيد

     درس سوم    

8- پلاسميد ها :

پلاسميد يك مولكول dsDNA   حلقوي  است كه  وارد باكتري ميشود و همانند سازي آن داخل سيتوپلاسم باكتري وبطورمستقل از ژنوم باكتري انجام ميگيردوبه آساني هم از باكتري استخراج ميشود.  هرپلاسميد داراي يك(ori)      Origin of Replication  ( منشاء همانند سازي ) است كه همانند سازي  پلاسميد از آن نقطه شروع ميشود . قسمتي از ترادف پلاسميد كه براي تعدادي از Restriction enzyme ها فقط يك جايگاه برش دارد و اين آنزيم ها در قسمتهاي ديگرترادف پلاسميد جايگاه برش ندارند  Multiple Cloning Site   گفته ميشود  وبراي  تهيه  Recombinant DNA  از آن استفاده ميشود يعني  مولكول DNA خارجي در اين قسمت كلون ( Clone )   ميگردد.تعدادي از پلاسميد ها در طبيعت يافت ميشوند (در باكتريها و مخمرها ) ولي در مقايسه با كروموزوم سلول ميزبان بسيار كوچكتر  مي باشند و اغلب در خارج كروموزوم باكتري ديده ميشوند.( تعدادي از پلاسميد ها براي كارهاي خاصي در آزمايشگاه طراحي و ساخته شده اند ).  اگر چه پلاسميدها براي زندگي سلول باكتري ضروري نيستند ولي حاوي ژن مقاومت  به يك آنتي بيوتيك ميباشند كه براي كارهاي مهندسي ژنتيك لازم و ضروري است. بعضي از پلاسميدها تعداد زيادي كپي در داخل سلول باكتري دارند كه بنام High copy number plasmid  گفته ميشوند(همانند سازي  اين پلاسميد ها به كروموزوم  باكتري بستگي ندارد) و Relaxed Plasmid هم گفته ميشوند . تعداد ديگري ازپلاسميدها تعداد كپي محدود تري در داخل سلول باكتري ايجاد ميكنند كه بنام Low copy number plasmid معروف هستند و باكتري شديدا" Replication آنها را كنترل ميكند و به Stringent Plasmid هم معروف ميباشند.  با تغييراتي كه در Sequence  پلاسميد ها ايجاد ميكنند صفات خاصي در آنها بوجود مي آيد كه در مهندسي ژننتيك استفاده ميشوند .چنانچه ori دو پلاسميد  از يك منشا باشند هنگام ترانسفورماسيون با هم رقابت كرده و فقط يكي از آنها وارد باكتري ميشود اما اگر منشا  ori  انها با هم اختلاف داشته باشد هنگام ترانسفور ماسيون  دو پلاسميد نيز ميتوانند وارد يك سلول بشوند ( اين مسئله در كارهاي كلونينگ اهميت خاصي دارد ).

كارهاي عملي در اين كار گاههاي آموزشي با دو پلاسميد انجام ميگيرد:

الف) پلاسميد pBR322  اين پلاسميد توسط فرانسيسكو بوليوار و همكاران طراحي و ساخته شده است و همه خصوصيات يك پلاسميد خوب را دارا ميباشد . وزن مولكولي پايين (4363bp ) دارد و براي تعدادي از Restiction Enzyme  ها فقط يك جايگاه برش دارد . اين پلاسميد داراي دوژن مقاومت به آمپي سيلين و تترا سيكلين  ميباشد و هنگاميكه وارد باكتري ميشود باكتري نسبت به دو آنتي بيوتيك  مذكور مقاوم ميشود.قسمتي از ترادف اين پلاسميد  (705bp ) را كه براي ادامه زندگي آن ضروري نميباشد  با آنزيم HaeII برش داده و حذف كرده اند واز آن  پلاسميدي بنام pT153 ساخته  اند كه همانند سازي آن 5-3 برابر پلاسميد PBR322  ميباشد .

 تصوير بزرگتر

شكل 1 نقشه ژني پلاسميد PBR322

ب) پلاسميد Bluescript sk  همانطور كه در شكل ديده ميشود ترادف ژن Lacz` ( قسمتN terminal  ژن β-galactosidase ) بطوري روي پلاسميد  تعبيه شده است كه Multiple Cloning Site اين پلاسميد قسمتي از ترادف ژن مذكور ميباشد. (جايگاه برش آنزيمها درقسمت هاي مختلف ترادف پلاسميد PBR322 قرار دارند ) كه  درمهندسي ژنتيك براي انتخاب كلني هاي سفيد باكتريايي حاوي  Recombinant DNA استفاده ميشود.  در دو طرف MCS   اين پلاسميد پروموتور فاژهاي  T3 و T7 قرار داشته كه  ژن كلون شده  را بر حسب Orientation  آن ميتوان توسط هر يك از پروموتورهاي  مذكور بيان ( Express) نمود .

شكل 2- نقشه ژني پلاسميد ( فاژميد ) Bluescipt sk

 اين پلاسميد داراي دو Original of Replication  است كه يكي از باكتري E.coli  و ديگري از فاژ F1 گرفته شده است كه به اين علت فاژميد هم گفته ميشود.. اين پلاسميد براي توليد ssDNA    هنگام  Sequencing  يك قطعه  DNA هم قابل استفاده ميباشد.  در Bluescript sk (M13) جايگاه آنزيم SacI بلافاصله در Downstream پروموتور فاژ T7 و جايگاه آنزيم KpnI بلافاصله در Downstream پروموتورفاژ T3 قراردارند. پلي كلونينگ سايت  Bluescript ks (M13))  در orientation مخالف  پلاسميد Bluescript sk (M13-)   قرار گرفته است.

شكل 3- اشتقاق پلاسميد ( فاژميد ) Bluescript II SK  از فاژ landa zap

شكل4 Multiple cloning site  پلاسميد ( فاژميد ) Bluescript II SK

9- استخراج پلاسميد  در مقياس كم   ( Minipreparation )

هدف از آموزش اين قسمت كسب مهارت براي استحراج پلاسميد از داخل باكتري ميباشد و همانطوريكه قبلا" گفته شد اين كار در مهندسي ژنتيك و بيولوژي مولكولي از اهميت بالايي برخوردار است. استخراج Plasmid DNA   با روش آلكالين وبه صورت  Miniprep  در موارد Colony screening  استفاده ميشود و براي كارهاي حساس تر پلاسميد بصورت Large scale  استخراج  ميگردد. ( دراين كارگاه  فقط Miniprep انحام ميشود).  براي استخراج پلاسميد سلول باكتري با محلول  GTE (  گلوكز، تريس ، EDTA   ) ليز شده و محتويات آن آزاد ميشوند . Genomic DNA  و پروتئينهاي سلولي را با محلول قليا ( NaOHو SDS ) دناتوره كرده(در اين روش DNA  سوپر كويل دناتوره نميشود) و بلافاصله با اسيدي كردن محيط و ايحاد سرما Genomic DNA و پروتئينهارا رسوب ميدهيم. در اين پروسه Plasmid DNA  بصورت محلول باقي ميماندكه توسط سانتريفيوژآنرا از فازآلي ( پروتئين ها ) جدا ميكنيم .

روش كار:

1- مقدار 5/1 ميلي ليتر كشت شبانه ( باكتري حاوي پلاسميد) را بمدت5 دقيقه  با 4500rpm سانتريفيوژ كنيد .  عده اي معتقدند چنانچه رسوب را با  محلول STE سوسپانسيون كرده و دوباره سانتريفيوژ كنيم ( شستشو دهيم ) واكنش هاي آنزيمي بهتر انجام ميشود

 [ STE = 100mM NaCl , 10 mMTris ( pH=8) , 1mM EDTA (pH=8)]

2- رسوب را در 100μl محلول I  سوسپانسيون   ( محلول  روي يخ سرد شده باشد )

  محلول I :   50mM glucose , 25mm Tris , 10 mM EDTA (pH 8)

3-. ميكرو فيوژ حاوي واكنش را مدت 10-5 دقيقه در هواي اتاق قرار دهيد

4.- مقدار 200μl از محلول II تازه تهيه شده به لوله واكنش  اضافه كرده ، درب لوله را ببنديد و با وارونه كردن آن محلول را خوب مخلوط كنيدو 5 دقيقه روي يخ قرار دهيد.

محلول II : 0.2N   NaOH, 1%  SDS

5- مقدار 150μl از محلول III  (سردشده روي يخ ) به لوله واكنش اضافه كنيد . درب لوله را بسته و به آهستگي 10 دفعه آن را وارونه كنيد ومدت 15 دقيقه روي يخ قرار دهيد.

 محلول III  : 60 ميلي ليتر 5M AcoK ,   اسيد استيك 5/11 ميلي لير, آب مقطر5/28 ميلي ليتر                ( اين محلول داراي 3مولار پتاسيم و 5 مولار استات است ) وقتي اين محلولبه واكنش اضافه ميشود بايد يك رسوب سفيد رنگ در داخل لوله پديدار گردد .

6- مدت 20 دقيقه با 12000xg آن را سانتريفيوژ كنيد

7- محلول رويي (تقريبا"  450 ميكرو ليتر  ) را به لوله ديگر انتقال دهيد( حاوي پلاسميد ميباشد)

8-  سديم استات با غلظت نهايي 0.3M به آن اضافه كنيد ( عده اي اين مرحله راضروري نميدانند )

9- دو برابر حجم آن اتانل مطلق سرد  اضافه كنيد

10-  مدت 15 دقيقه آن را سانتريفيوژ كنيد تا plasmid DNA   رسوب كند . الكل  را حذف كنيد ( حتما" لوله را وارونه  روي كاغذجاذب الرطوبه قرار دهيد ).

11-  روي  رسوب  الكل 70درجه ( 100 ميكرليتر)  اضافه كنيد و آن را ورتكس كنيد بطوريكه pellet كنده شده و در الكل شناور شود

12- مدت 3دقيقه در حرارت اتاق آن را سانتريفيوژ كنيد ( شستشو دادن با الكل )

13-  الكل را خالي كرده ورسوب را در حرارت 70 درجه خشك كنيد .

14-  رسوب را در 50 ميكروليتر آب يا  بافر TE )) حل كنيد

TE= 10mM Tris pH 8 , 1mM EDTA pH 8

10-  استخراج پلاسميد در مقياس بالا  (Large scale Plasmid DNA preparation)  :

1. مقدار 500 ميلي ليتركشت شبانه را  با 4000g به مدت 10 دقيقه  سانتريفيوژ كنيد.   مايع رويي را خالي كرده و لوله را وارونه روي كاغذ خشك كن قرار دهيد تا درناژشود. رسوب را با STE سوسپانسيون نموده و دو بار ه سانتزيفيوژ كنيدو سپس لوله وارونه قرار داده تا درناژ شود.

 [ STE = 100mM NaCl , 10 mMTris- base  ( pH=8) , 1mM EDTA (pH=8)]

2. رسوب را در10 ميلي ليتر محلول I  حل كنيد.

 Solution I: 50 mM glucose , 25 mM Tris ( pH 8), 10 mMEDTA

3. آن را خوب سوسپانسيون كنيد  و 10 دقيقه در هواي اتاق قرار دهيد

4. مقدار 20 ميلي ليتر از محلول II تازه تهيه شده     به آن اضافه كرده درب لوله را ببنديد و با وارونه كرده آن محلول را خوب مخلوط كنيدو 5 دقيقه روي يخ قرار دهيدمحلول

 Solution II:  0.2N  NaOH, 1% SDS

5. مقدار 15 ميلي ليتر از محلول III به به واكنش  اضافه كنيد و15 دقيقه لوله را روي يخ قرار دهيد

Solution III : 60 ml of 5M ACOK , 11.5 ml of Acetic Acid , 28.5 ml of ddH2O

 ( اين محلول داراي 3مولار پتاسيم و 5 مولار استات است ) وقتي اين محلول اضافه ميشود بايد يك رسوب سفيد رنگ پديدار گردد ( ميتوان باپروخالي كردن محلول توسط  پيپت پروتئينها را شكست )

6. مدت 20 دقيقه با 20000xg  آن را سانتريفيوژ كنيد

7. محلول رويي  ر ا (تقريبا" مقدار 15 ميلي ليتر) به لوله جديد انتقال دهيد

8. مقدار0.6  حجم اوليه ( 12 ميلي ليتر ) ايزو پروپانل  به آن اضافه كنيد وخوب مخلوط كرده و  15 دقيقه در حرارت اتاق قرار دهيد

9. درحرارت اتاق و مدت 15 دقيقه  آن را سانتريفيوژ كنيد تا plasmid DNA  در ته لوله رسوب كند ( توجه : اگر در 4 درجه انجام شود نمك ها  رسوب ميكنند )

مايع رويي را حذف كنيد ( حتما" لوله را وارونه قرار دهيد ) و رسوب رابا  الكل 70درجه  و در حرارت اتاق شستشو دهيد ( مقدار 10 ميلي ليتر الكل 70 درجه به هر لوله اضافه كرده و با 17000g   بمد ت  10 دقيقه سانتريفيوژ كنيد ). الكل را خالي كرده و آن را در حرارت 70 درجه خشك كنيد.  رسوب را با 8 ميلي ليتر آب يا بافر TE حل كنيد .

11- هضمDNA  باآنزيم هاي محدودكننده (restriction digestion ) ( كارها روي يخ انجام گيرد):

هر يك ازآنزيمهاي محدودكننده ( برش دهنده )  ترادف خاصي را روي رشته DNA شناسايي كرده ودورشته DNA  را برش ميدهند . آنزيمها ي محدود گر در مهندسي ژنتيك ازاهميت بالايي بر خوردارند و در حقيقت شبيه چاقوي جراحي براي مهندسان ژنتيك ميباشند ( به جدول آنزيمها مراجعه شود ).

1-. مقدار پلاسميد  را تخمين بزنيد ( يك واحد آنزيم مقدار يك ميكرو گرم DNA  را در حرارت مناسب در مدت يك ساعت هضم ميكندويك ميكروگرم DNA  را در يك واكنشي به حجم 20-30 ميكروليتر با آنزيم هضم كنيد)

2-  باآب مقطر حجم آن رابه 18 ميكرليتر ( يا هرحجم مورد نظر) برسانيد

3- لوله واكنش را spin  كنيد

4- مقدار 2ميكروليتر از  10x Reaction buffer  به واكنش اضافه كنيد(غلظت نهايي بافر 1x باشد)

5-  با استفاده از سرسمپلر استريل و سرد  مقدار آنزيم مورد نظر را به واكنش اضافه نماييد ( اين مقدار آنزيم بايد در حجم نهايي در نظر گرفته شده باشد).

6- با ضربه نوك انگشت واكنش را مخلوط كرده و سپس spin نماييد.

7-  مدت يك  تا دوساعت در حرارت مناسب انكوبه كنيد

مقدار 15 ميكروليتر از واكنش را با 3 ميكرو ليتر loading buffer  مخلوط كرده و روي ژل آگارز با درصد  مناسب الكتروفورزنماييد ( از Intact plasmid DNA  بعنوان كنترل واكنش روي ژل دركنارنمونه الكتروفورز شود  توجه : اگر DNA  هضم نشده است آن را P.C.I extraction  نموده و با الكل رسوب داده وواكنش را تكرار كنيد ).

     درس چهارم    

 الكتروفورز DNA

براي تاييد انجام كارهاي مهندسي ژنتيك با يد تغييراتي كه روي  DNA ايجاد  شده است  رويت گردند، مشاهده DNA  متعافب الكتروفورز روي ژل آگارز يا پلي آكريلاميد و رنگ آميزي با اتيديوم برومايد امكان پذير خواهد بود. براي انتخاب درصد آگارز از جدول شماره 2  استفاده ميشود:

جدول شماره 2 - قدرت جداسازي مولكولهاي DNA  توسط غلظتهاي مختلف آگارز

12- تهيه  ژل  آگارز

1-  قالب ژل را آماده كنيد

2- شانه اي با دنده هاي مناسب روي قالب قراردهيد

3- حجم ژل مورد نظر را تعيين كنيد ( اندازه گيري طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )

4- پودر آگارز را وزن كنيد

5- آگارز را در بافر 1xTBE حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر 10 ميلي ليترژل  يك ميكروليتر از محلول   10mg/ml  اتيديوم برومايد اضافه كنيد  سپس آن را خوب مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد

1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8

6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد

7- هر 5 ميكروليترنمونه را با يك ميكروليتر بافر نمونه مخلوط كرده و داخل چاهك هاي ژل بريزيد (اين بافر حاوي 50درصد ماده سنگين كننده مانند گليسرين يا ساكارز است كه نمونه بخوبي داخل چاهك  ريخته ميشود  و همچنين حاوي0.2 درصد از يك رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو يا گزيلن سيانول ميباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با  500bp  و درژل 0.8 درصد با 1000bpحركت ميكند )

جدول شماره 3 :  مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA   روي ژل آگارز

جدول شماره 4 :  مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA   روي ژل  پلي آكريلا ميد

8.- بافر تانك بايد كاملا" روي  ژل  را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهك ها ريخته شوند. (از بافرهاي مختلف استفاده ميگردد.   بهتر است هنگام الكتروفورز به ازاي هر ميلي ليتر بافر تانك  (TBE buffer) يك ميكرو ليتر از اتيديوم برومايد 10mg/ml  اضافه شود.

9- DNA داراي شارژ منفي است و براي الكتروفورز شدن بايد  نمونه بطرف قطب منفي با شد  تا هنگام الكترو فورز به سمت قطب مثبت حركت كند

10- تانك الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل كنيد

11-  پيچ Current را روي ماكزيمم قرار داده و ولتاژ را تنظيم كنيد (10V/centimetr )

وقتي رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طي كرد ژل را از تانك خارج كرده بانورUV نتيجه را مشاهده كنيد .

13- تهيه ژل پلي آكريلاميد :

قدرت تفكيك سازي اين ژل بسيار بالا است و قطعات DNA  با طول كم نيز در اين ژل قابل رويت ميباشند و بسته به در صد ژل حتي اختلاف يك باز را ميتوان در قطعات DNA  الكتروفورز شده مشاهده نمود .

1. شيشه ها، شانه ( Comb )  و فضاسازها ( Spacer)   را با آب و دترژان خوب بشوييد و سپس با الكل 70 در صد آنهارا تميز كنيد تا چربي دستها روي آنها باقي نماند ( بجاي پنبه  از گاز استفاده كنيد زيرا پرزهاي پنبه روي شيشه باقي ميمانند ) .

2. قالب ژل را آماده كرده و جهت جلوگيري از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گيري   (Seal)  نماييد .

3. حجم قالب (cast ) را  ( حجم ژل) با اندازه گيري طول وعرض قالب مشخص نماييد ( قطر ژل بسته به قطر فضا سازها يك و يا نيم ميليمتر است )

4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آكريلاميد و بيس آكريلاميد لازم  را (بصورت مخلوط 29  در صد آكريلاميد و 1درصد بيس آكريلاميد تهيه و در يحچال نگهداري ميشود) داخل لوله تميز بريزيد

5. از بافر 10xTBE  با غلظت نهايي 1x  اضافه كنيد وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانيد

6. مقدار 100 ميكرو ليتر آمونيوم پرسولفات 10درصد و 3 ميكرو ليتر محلول TEMED  به آن اضافه كنيد ( توجه داشته باشيد كه مونومرهاي  اكريلاميد وبيس آكريلاميد در حال پليمريزه شدن هستند)

7. به آرامي  محلول را در قالب از قبل آماده شده بريزيد و مراقب باشيد كه حباب هوا وارد آن نشود زيرا حباب هوا مانع انجام الكترو فورز ميشود .

8. به آرامي شانه را داخل قالب قرار دهيد تا بعد از پليمريزه شده ژل ، درون آن چاهك هايي جهت نمونه گذاري ايجاد شود

9. بعد از پليمريزه شده به آرامي شانه را درآورده و چاهك هارا با آب بشوييد تا اگر مونومرهاي پليمريزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند

10. گيره پاييني   را باز كنيد  وفضاساز پاييني   را از قالب خارج كنيد

11. گيره هاي طرفين را باز كرده و دستگاه را طوري داخل تانك مخصوص قرار دهيدكه قسمت بريده شده  شيشه رويي  ( Notch )  به سمت محفظه بالايي (  تانك  فوقاني) قرار گيرد

12. شيشه هاي دستگاه ( قالب) را با نصب گيره ها ي مخصوص به طرفين تانك ,  ثابت نماييد

13. محفظه هاي بالا و پايين تانك را با  1xTBE buffer  پرنماييد بطوريكه بافر روي چاهك ها را بپوشاند. چنانچه بين  دوشيشه قالب ( محل خارج كردن فضاساز پاييني ) كه در محفظه پاييني تانك قرار دارد حباب هوا مشاهده ميشود با يك سرنگ پر از بافر كه دار اي سر سوزن كج است حباب هوا را بيرون كنيد تا مانع جريان الكتريكي نشود و الكترو فورز بخوبي انجام گيرد

14. محصول PCR  را ( همانند الكتروفورز با ژل آگارز)  با بافر نمونه گذاري مخلوط كرده و توسط سرنگ هاميلتون نمونه گذاري را روي ژل انجام دهيد

15. محفظه بالايي تانك  را به قطب منفي ومحفظه پاييني  را به قطب مثبت منبع تغذيه وصل كرده و الكتروفورز كنيد 

16. بعد ازخاتمه الكتروفورز ( وقتي رنگ نشانه به پايين ژل رسيد) جريان برق را قطع كرده و شيشه را از تانك جدا كنيد. با يك تيغه فلزي نازك به آرامي بين دو شيشه فشار آوريد تا دو شيشه از هم جداشوند . ژل به يكي از دو شيشه مي چسبد . به آرامي آنرا  داخل آب حاوي 10 ميكروگرم درهرميلي ليتر اتيديوم برومايد قرار دهيد تا بعد از چند دقيقه ژل رنگ شود .

ژل را روي دستگاه UV Transilluminator  قرار داده و نوارهاي  هاي DNA  را مشاهده كنيد.

تنظيم بيان ژن (Regulation of gene Expression)

با توجه به عمل متفاوت ژن‌هاي مختلف،‌ همه آنها در همه شرايط روشن نيستند. به عبارت ديگر در هر شرايط، تنها گروهي از آنها روشن هستند و بقيه خاموش مي‌شوند. مكانيسم‌هاي مختلفي براي تنظيم روشن يا خاموش كردن ژن‌ها در پروكاريوت‌ها و يوكاريوت‌ها به كار گرفته مي‌شود.

1- تنظيم بيان ژن در پروكاريوت‌ها

تحقيقات اوليه انجام‌شده بر روي آنزيم‌هاي مؤثر در متابوليسم لاكتوز نشان داد كه به طور كلي ژن‌هاي موجود در باكتري‌ها را مي‌توان به دو دسته تقسيم كرد: ژن‌هاي دائمي‌ و ژن‌هاي قابل كنترل.  

1-1  ژن‌هاي دائمي‌: به ژن‌هايي گفته مي‌شود كه تنظيم بيان آنها مستقل از غلظت سوبستراي محيطي است. بيان اين ژنها نسبتاً ثابت است. به عبارت ديگر فعاليت اين ژن‌ها با سرعت ثابت به طور دائمي صورت مي‌گيرد.  

1-2- ژن‌هاي قابل كنترل: به ژن‌هايي گفته مي‌شود كه ميزان بيان آنها ثابت نيست و برحسب شرايط محيطي تغيير مي‌كند. ژن‌هاي قابل كنترل به دو دسته القايي و سركوب‌شونده تقسيم مي‌شوند.

الف: ژن‌هاي القاء شونده (Inducible genes)

محصول اين ژن‌ها در حضور يك مولكول اختصاصي افزايش مي‌يابد. براي مثال توليد بتاگالاكتوزيداز (لاكتاز) با حضور سوبستراي آن (لاكتوز) در محيط كشت افزايش مي‌يابد.

ب: ژن‌هاي سركوب‌شونده (Suppressible gene)

محصول اين ژن‌ها در حضور يك ماده به خصوص كاهش مي يابد.

 در هر صورت، تنظيم ژن‌هاي باكتريايي عمدتاً از طريق كنترل همزمان چند ژن (اپرون) صورت مي‌گيرد.

 تعريف اپرون

طبق تعريف "اپرون" به گروهي از چند ژن متوالي اطلاق مي‌شود كه تنها داراي يك پروموتر واحد هستند و هماهنگ با هم تنظيم مي‌شوند. در واقع به هر يك از توالي‌هاي سازنده يك پلي‌پپتيد در يك اپرون سيسترون گفته مي‌شود. عمل محصولات مربوط به سيسترون‌هاي مختلف يك اپرون،‌ به طريقي مرتبط با هم است. به عبارت ديگر يك اپرون مثلا مي تواند ساخت هماهنگ چند آنزيم مربوط به يك مسير متابوليكي خاص را بر عهده داشته باشد. اولين اپرون شناخته شده اپرون لاكتوز است كه توسط «ژاكوب و مونود» معرفي شد. به طور كلي هر اپرون شامل قسمت‌هاي زير است:

1-     ژن‌هاي ساختماني (Structural genes)

محصولات اين ژن‌ها ممكن است آنزيم، انواع پروتئين‌هاي ديگر، tRNA يا rRNA باشند. محصولات ژن‌هاي ساختماني براي بقاي سلول ضروري هستند.

2-    توالي‌هاي تنظيمي (Regulatory Sequence)

اين توالي‌ها شامل پروموتر،‌ اپراتور، توالي‌هاي تضعيف‌كننده و ساير توالي‌هاي تنظيمي مانند جايگاه اتصال به CAP مي‌باشند. اين توالي‌ها در واقع نوعي عنصر پاسخ‌دهنده سيس[1] هستند.

تنظيم اپرون ها

عمل يك اپرون توسط ژن‌هاي اختصاصي صورت مي‌گيرد كه با وجودي كه محل آنها ممكن است نسبت به اپرون دور يا نزديك باشد، ولي محصول آنها با اتصال به توالي‌هاي تنظيمي، عمل خود را انجام مي‌دهد. به طور كلي ژن‌هاي تنظيم كننده را جزء ساختمان اپرون در نظر نمي‌گيرند و محصول آنها در واقع نوعي فاكتور پاسخ‌دهنده ترانس[2] هستند.

طبقه‌بندي اپرون‌ها

براساس نوعي طبقه‌بندي اپرون‌ها را به انواع كاتابوليسمي و آنابوليسمي و غيره طبقه‌بندي مي‌كنند. در اينجا از نوع كاتابوليسمي،‌ اپرون لاكتوز و از نوع آنابوليسمي، اپرون تريپتوفان توضيح داده مي‌شوند.

کروموزوم پلی‌تن

    کروموزوم پلی‌تن، کروموزوم غول پیکری است که در غدد بزاقی مگس سرکه وجود دارد و به دانشمندان کمک می‌کند تا تغییرات ژنتیکی را بررسی کنند و از تقسیمات سلولی ایجاد می‌شود که طی آن DNA همانندسازی می‌کند ولی تقسیم هسته و سلول صورت نمی‌گیرد. با قرار گرفتن DNAها در کنار هم اجتماع غول پیکری از 1000 مولکول DNA حاصل می‌شود که با میکروسکوپ نوری قابل مشاهده است.

    در حالت عادی کروموزوم‌ها در سلول جدا هستند ولی در سلول‌های دارای پلی‌تن کروموزوم‌ها از ناحیه سانترومر به هم متصل می‌شوند و یک رشته بزرگ و ضخیم را تشکیل می‌دهند و به محل اتصال سانترومرها که حجیم شده است،کروموسنتر می‌گویند.

    کروموزوم موجود در غدد بزاقی مگس سرکه دارای چندین بازوست. در سلول به ازای هر کروموزوم، یک کروموزوم همتا (همولوگ) وجود دارد. در کروموزوم پلی‌تن کروموزوم‌های همتا از هم جدا نیستند بلکه این کروموزوم متصل و در جوار کروموزوم اصلی است (کروموزوم‌های همولوگ در کنار هم هستند).

    در رنگ‌آمیزی پلی‌تن باندهای تیره و روشن دیده می‌شود که هر کدام الگوی خاصی دارند و در مگس‌های مختلف یکسان است (الگوی یکسانی دارند). هر گونه تغییر روی این ژن‌ها سبب تغییر در ساختار بازوها می‌شود که به خوبی قابل تشخیص است و می‌توان از روی آن ناهنجاری کروموزومی را تشخیص داد.

    سلول‌های حاوی کروموزوم پلی‌تن مانند سلول‌های دیگر متابولیسم‌های شیمیایی را انجام می‌دهند، برای سنتز RNA مولکول‌های DNA موجود در یک قسمت باز می‌شوند، به این نواحی puff می‌گویند.

    مگس سرکه در حالت لاروی بررسی می‌شود چون راحت‌تر است در مطالعات کلاسیک از نوع خاصی استفاده می‌شود. لارو مگس باید در محیط سرد (حدود 18 درجه سانتیگراد) رشد کند تا جثه‌اش بزرگ‌تر شود.

    بیشتر حشرات دارای کروموزوم پلی‌تن هستند.

1- چرا در کروموزوم پلی تن، کروموزوم 4 و X بازو ندارند؟

در مگس سرکه کروموزوم‌های بزرگ شماره 2 و 3، متاسانتریک هستند (سانترومر در مرکز قرار دارند) در نتیجه هر یک دارای دو بازو راست و چپ هستند. کروموزوم‌های 4 و X بازویی ندارند چون سانترومر آن‌ها در انتهای کروموزوم قرار دارند و تلوسانتریک هستند.

2- اگر ساختار کروموزوم پلی‌تن در مگس نر و ماده وجود دارد چرا در مگس نر کروموزوم Y وجود ندارد؟

کروموزوم Y به صورت هتروکروماتینی است و در منطقه کروموسانترومر قرار دارد در نتیجه دیده نمی‌شود.

3- در بازوی R2 در قسمتی کروموزوم‌های همولوگ از هم جدا هستند، آیا در کروموزوم‌های دیگر هم این ناحیه وجود دارد؟

با بررسی بیشتر تصاویر در منابع مختلف این فاصله در کروموزوم‌های دیگر مانند L3 نیز وجود دارد.

4- بهترین مگس سرکه‌ای که برای مطالعه غدد بزاقی به‌کار می‌رود، کدام است؟

‌Drosophila virilis گونه مناسبی از مگس سرکه است که می‌توان از آن برای مشاهده غدد بزاقی استفاده کرد چون نسبت بهD. melanogaster   بزرگتر است و غدد بزاقی به راحتی پیدا می‌شوند.

5- چرا قبل از رنگ‌آمیری اسید کلریدریک به کار می‌بریم؟

اسیدکلریدریک باعث هیدرولیز DNA  کروموزوم‌های پلی‌تن شده و رنگ‌پذیری آن‌ها را افزایش می‌دهد